1． 前言

采用经典的逐步合成，由于肽链延长，偶合效率会大大下降导致合成产品纯度很低，而采用CSPPS，可以合成复杂或者困难的多肽，甚至是小蛋白。CSPPS在合成保护多肽片段过程中，可以选择固相也可以选择液相，但都涉及选择氨基酸保护策略以及多肽合成树脂，一般合成都采用CLTR树脂和Fmoc氨基酸。

2． 固相合成多肽片段

2.1．片段选择

由于片段缩合过程中采用片段活化方法进行连接，因此可能产生的消旋化会比但个氨基酸困难多了，但是在合成一些有可能产生β折叠的困难多肽中，采用片段合成会大大提高缩合效率，因为我们可以选择断裂β折叠结构的两个片段，由于采用N到C端的方法仍然处于探索阶段，现在仍然以C到N端为主。考虑合成片段本身的纯度，一般片段选择在15个氨基酸以内的肽段，因为这样肽段纯化相对比较容易。另外考虑片段合成消旋及最后产率，对C端，N端的氨基酸选择有一些经验可以借鉴，如在C端，采用G、P、K（BOC）、E（OTBU）比较多点，N端选择G、A、D（OTBU）、K（BOC）、S（TBU）比较多点。当然缩合效率与树脂的性质也有很大关系，而且一般认为N-端比C端影响更大。

2.2．合成肽段

2.2.1．采用CLTR树脂合成，反应速度快，产率高，而且没有消旋化，在Fmoc氨基酸连接到CLTR上的时候，必须迅速将Fmoc脱去，一般分为两步，先用25% 哌啶/DMF，脱3min，在脱20min。免得导致将氨基酸从树脂上切割下来。合成后脱除了Fmoc之后，可以采用HBTU/HOBT/DIEA（1/1/2）接入第二个Fmoc氨基酸，一般不采用DIC（DCC）/HOBT方法，因为该方法回导致0.5-2.5%的三肽形成，这个主要是生成的二肽从树脂上切割下来重新连接到树脂上所生成的，以后的合成适用各种合成方法。

2.2.2．切割方法

将肽段从CLTR树脂上切割下来，可以采用的方法很多。

2.2.3．纯化方法

由于一般合成多肽的极性相当低，采用C8，0.5% TFA，检测波长265nm，纯化中需要采用较高的ACN起始浓度，而且一般采用等度洗脱。也可以通过合成中引入侧链没保护的N，Q，增加极性，或者采用S（Trt）、T（Trt），Y（Clt），这些保护基团在切割后可以同时脱除，也起到增加极性的目的。

1． 固相片段缩合

3.1．C端肽段连接到树脂

虽然可以直接按照逐步合成先在CLTR上合成一个肽段，但是可能出现每步合成效率不够高，而导致合成肽链不纯，因此，有中方法就是将合成并纯化好的肽段连接到CLTR树脂上，考虑合成肽段比较昂贵，一般只采用1-1.5倍过量的肽段进行反应，反应可以采用HPLC监测，反应结束后也要脱Fmoc，5% 哌啶/DMF，5min，再用25%哌啶/DMF，20min。然后依次用DMF，DMSO，ISOPROPANOL，HEXANE洗涤，真空干燥，放置-20℃保存。

3.2．活化及缩合多肽片段

在缩合肽段过程中，溶剂，缩合试剂选择对减少消旋，提高产品纯度有重要作用。采用通常的BOP，HBTU，TBTU，HATU，产生的消旋化程度非常高，达70-90%，而且采用DMF为溶剂，长时间的反应还会引起Fmoc的脱落，而采用DMSO为溶剂，消旋可以降低到1%，DCC（DIC）/HOBt（DhbtOH）缩合方法要优越。一般反应时间不超过6h，如果6h还不能检测通过，在缩合一次。连接之后，反应结束后也要脱Fmoc，5% 哌啶/DMF，5min，再用25%哌啶/DMF，20min。然后依次用DMF，DMSO，ISOPROPANOL，HEXANE洗涤，真空干燥，放置-20℃保存。

2． 液相片段缩合

4.1．液相片段缩合

CSPPS，尽管可以通过选择肽段，保护基，缩合方法，仍然有一些肽段无法通过该方法合成，而采用液相片段缩合可以完成，而且价格也比较便宜。液相合成一般先合成片段，并将其中一个片段与2-chlorotrityl chloride反应生成2-chlorotrityl esters，再用4% 哌啶/DMF/THF，室温下反应2h。反应结束后，2-chlorotrityl esters可以用TFE/DCM（3/7）反应45min。如果其中一个片段是酰胺化的，采用DIC/HOBt·NH₃，DMSO为溶剂反应可以完成酰胺化。

4.2．双向合成——采用氨基酸侧链连接CLTR树脂

CSPPS合成过程中，采用CLTR树脂，Fmoc-氨基酸，通常采用H（Mmt）、C（Mmt）、K（Mtt）、S（Trt）。其它氨基酸都采用tBu保护，采用1% TFA切割，可以同时脱去上面几个氨基酸的侧链保护基，而且不影响H（Trt），C（Trt）。4-methoxytrityl chloride 树脂用于H，C；2-chlorotrityl chloride树脂用于K，S。

3． 切割，纯化已经纯度确定

在合成大肽过程中，切割一般采用三步切割方案：先将Fmoc-肽段从CLTR上切割下来；用65% TFA/DCM/EDT（95/5），室温下1h，溶剂蒸发后，乙醚沉淀；用TFA/H2O/EDT（90/5/5）反应4h，去掉所有Pmc，Pbf，在浓缩，乙醚沉淀，RP-HPLC纯化，在用5% 哌啶/水 脱N端Fmoc，时间1-2h，混合溶液用10% 醋酸酸化，乙醚萃取掉Fmoc脱出产物，冻干后，用RP-HPLC分离纯化。